为什么说菌群鉴定到”种”很重要

平时交流的时候，我们常说菌群分类学鉴定应该到“种”（species）水平，然而，我们还是常常基于“属”（genus）水平的菌群分类结果，进行多样性分析和差异菌群筛选，没到“种”水平，似乎也没有多大影响。真的没关系吗？我们来具体说说。以下以细菌为例。

菌群分类到属水平够了吗？

我们知道，菌群不仅对人自身环境也对人以外的环境有着广泛深刻的影响。菌群的世界异常纷繁复杂，最新的Silva数据库（138.1）中已收录超过198万条细菌16S序列。为了便于弄清不同类群之间的亲缘关系和进化关系，我们将菌群按界（Kingdom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）加以分类。种是细菌分类的基本单位。菌属是由性状相近关系密切的若干菌种组成。一个属包含若干个种，在数量上是个什么水平？

以文献中经常看到的拟杆菌属（Bacteroides）为例，这个属是临床上最重要的革兰阴性无芽胞厌氧菌，属内有78个种和5个亚种，与人类有关的有10个种，常见的隶属于拟杆菌属的种有：脆弱拟杆菌（B. fragilis）、解脲拟杆菌（B. ureolyticgs）、金斯坦拟杆菌（B. goldsteinii）、粪居拟杆菌（B. coprocola）、卵形拟杆菌（B. ovatus）、多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron）、诺德拟杆菌（B. nordii）、艾格斯拟杆菌（B. eggerthii）、内脏拟杆菌（B. splanchnicus）、多毛拟杆菌（B. capillosus）、粪拟杆菌（B. caccae）、屎拟杆菌（B. merdae）、粪便拟杆菌（B. stercoris）、化脓拟杆菌（B. pyogenes）、隐蔽拟杆菌（B. tectum）和凝固拟杆菌（B. coagulans）等。

根据数据库中报道的细菌信息，几乎没有哪个菌属是唯一对应一个菌种的。这就是说，尽管我们已经将菌群鉴定的分类学水平缩小到属，但是仍然无法明确地鉴定出起作用的关键菌种，并且无从猜测。

图1 分类学的各个层次

菌群分类到属水平，对研究有什么影响？

在一个具体的课题中，比如菌群与某疾病的关系，如果是粗略地讨论菌群的多样性并筛选出差异的菌群，鉴定菌群到属水平，虽然分类不够明确，但目前发文章是可以接受的。然而，如果我们要在相关性基础上，进一步讨论菌群与疾病发生的因果关系（作用机制）时，若不能鉴定到具体的菌种，我们将无法继续开展体内体外的表型和功能验证实验，自然也无法为后期的临床转化提供详实可靠的数据（微生物组因果性研究怎么做？Nature子刊告诉你答案）。深入研究的案例，我们之前也解读了许多（Nat Med：肠道菌群–胆汁酸–白介素22轴协同调节多囊卵巢综合征 | 微生物专题，NC文章教你做高质量的肠道菌群队列研究 | 项目文章），不多赘述。即想要深入地开展菌群的机制研究，包括筛选出更为特异的菌群诊断标志物，都需要在种水平上开展讨论。

我们有办法鉴定菌群到种吗？

16S rDNA序列一直是鉴定细菌的金标准，本身是可以基于数据库鉴定细菌到种水平。然而，受二代测序短读长的影响，常规16S rDNA测序只能妥协于对16S的部分可变区（如V3-V4）进行测定，通常仅占全长16S序列（约1.5 Kb）的30%左右，使得菌群鉴定的分辨率和准确性都打了折扣。由此常规16S测序，一般只能准确获取属水平的菌群分类鉴定结果，而丢失了大部分更为重要的种水平信息（并不是我们不想在种水平做讨论）。

我们现在有办法方便地获取全长16S序列，来恢复鉴定菌群到种水平吗？

有的。

目前采用三代测序平台PacBio的新款测序仪，借助其超长的测序读长（平均约15 Kb，最长可达25 Kb），平均可达16S rDNA序列长度的10倍，因此可以轻而易举地获取全长16S序列（囊括全部9个可变区V1-V9），进而实现“种”水平的菌群多样性分析。这种全长16S测序的种水平平均注释率≥ 60%，约是常规16S测序的种水平注释率的10倍，并且消除了使用部分可变区进行注释的物种偏好性。除了全长16S测序，采用宏基因组测序也能鉴定菌群到种甚至到株水平，当然它的作用更在于菌群基因的预测和功能分析。如果经费充裕，宏基因组测序也是可选的工具。

图2 计算机模拟评估不同可变区进行种水平菌群准确分类的能力（Johnson et al. Nature Communications 2019）

发现不同的可变区对种水平的分类能力存在较大偏差且有偏好性，全长16S（V1-V9）可实现几乎所有的序列注释到物种上。图中颜色越红代表不能鉴定到种的比例越高。

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